第一及通讯作者：KatariinaM.M.P?rn?nen；MarkoVirta
作者单位：芬兰赫尔辛基大学
发表时间：-3-27
摘要
综合监测抗生素抗性(Antibioticresistance,AR)是世界卫生组织抗生素抗性全球行动计划的目标之一。城市污水处理厂(Urbanwastewatertreatmentplants,UWTPs)是环境中AR最重要的受体和污染源之一。基于对欧洲由北向南在临床上抗生素抗性出现流行率增加的一致观测，本研究比较了位于七个国家(葡萄牙、西班牙、爱尔兰、塞浦路斯、德国、芬兰和挪威)的12个UWTPs的进水和最终出水。利用高通量定量PCR，分析了个抗性基因和25个可移动遗传元件。此次监测表明，UWTPs的抗生素抗性侧面反映了在临床上观测到的抗生素抗性梯度变化。抗生素的使用、环境温度和UWTPs的大小是与抗生素抗性在环境中的持久性和传播相关的重要因素。这些结果强调了实施定期监测和控制措施的必要性，而这些措施可能需要适合的地理区域。
试验方案
对于来自七个欧洲国家在年初秋、年初春以及年初秋三个时间点的UWTPs的个污水样品，分别提取总DNA并对其浓度和质量进行测定。用0.22μm硝酸纤维素膜过滤1mL污水或适当的梯度稀释液，在相应培养基上孵育24h、48h后分别得到污水样品中粪大肠杆菌和肠球菌并进行计数(三次重复)。在含阿莫西林(32mg/L)、四环素(16mg/L）和环丙沙星(1mg/L)之一的选择培养基上培养出抗生素抗性菌。qPCRArray使用微流控智能芯片多点纳米分送器将引物和来自孔板的样本装载到具有个反应孔的智能芯片(Takara)中，扩增后计算Ct值。通过选择符合质量标准的qPCR芯片数据，分析得出定量qPCR和半定量qPCRarray之间的总体趋势相似。利用参考基因和相关基因的Ct值应用公式:2(Ctreferencegene?Cttargetgene)计算扩增子的相对丰度。使用Rv3.4.0进行统计分析；Spearman方法计算相关性；Mann-WhitneyU检验数据的平均值和显著差异；采用log10(进水相对丰度)-log10(出水相对丰度)计算抗性基因和遗传转移重组类的丰度对数减少量；用veganv2.4和stats软件包计算PCoA。
主要结果
1、耐药基因组地理分布：监测到的ARG分布支持了概念上的EARS-NET(欧洲抗生素抗性监测网络)抗生素抗性梯度。来自南部国家(葡萄牙、西班牙和塞浦路斯)和北部国家(德国、挪威和芬兰)UWTPs的进水中ARGs的相对丰度单独聚类(R2=0.37,P=0.,图1A)。欧洲UWTPs出水中，HAC(高抗生素消费国家)和LAC(低抗生素消费国家)没有聚集在一起(R2=0.11,P=0.，图1B)。(国家:HAC-PT葡萄牙、ES-西班牙、CYP-塞浦路斯、IL-爱尔兰；LAC-DE-德国、FI-芬兰、NO-挪威。)
图1利用Bray-Curtis差异指数显示抗性基因和可移动遗传元件分布的PCoA
2、进水耐药基因组：HAC国家对氨基糖苷类、磺酰胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类、酰胺醇类和多重耐药抗性基因的相对丰度高于LAC国家(P0.01，Mann-WhitneyU检验)，但对于四环素和MLSB抗性基因则是相反的情况(图2A)。LAC国家的插入序列相对丰度高于HAC国家(P0.01,Mann-WhitneyU检验)。在HAC同一抽样的3天中，编码酰胺醇、β-内酰胺、磺胺抗性基因和整合酶的相对丰度比LAC国家的日变化显著高(图2B)。
图2HAC和LAC的UWTPs进水样本中检测到ARGs(A)和MGEs(B)的相对丰度
3、出水耐药基因组：对于大多数氨基糖苷类、磺胺类、β-内酰胺类、MLSB、四环素、喹诺酮类、酰胺醇类和多重耐药的ARGs，HAC最终出水的ARGs相对丰度明显高于LAC(P0.01，Mann-WhitneyU检验)(图3A)。对于编码整合酶和转座酶的基因也同样检测出HAC高于LAC(图3B)。经UWTPs处理后，HAC中四环素和MLSB耐药基因的相对丰度显著高于LAC国家(P0.01,Mann-WhitneyU检验)(图3)。
图3HAC和LAC的UWTPs出水样本中检测到ARGs（A）和MGEs（B）的相对丰度
4、污水处理厂对ARG的处理效果：比较HAC和LAC国家UWTPs的ARG对数减少值，其中“0”表示处理不影响累积ARG相对丰度，正值表示减少，负值表示增加。尽管HAC和LAC国家处理后大多数ARG的相对丰度都有所下降，但除了万古霉素抗性基因、整合酶和转座酶基因外，HAC组的出水中大多数ARG的相对丰度都明显较高(图4)。此外，还检测到LAC国家的磺胺类抗性基因略有富集(图4A)。
图4HAC和LAC国家污水处理厂进水和出水ARG的变化
5、ARGs相对丰度与临床分耐药离株表型之间的关系：在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的临床分离株中，几种ARGs（氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类）的相对丰度与典型的表型抗性菌的流行显著相关。(图5)。
图5UWTP污水中ARGs相对丰度与临床分离株表型抗性的数据之间的关联。
总结
通过评估位于七个国家的12个UWTPs中ARGs相对丰度，实现了首次对欧洲UWTPs中ARGs的综合监测，结果表明UWTPs的AR流行与在临床上所监测到的AR流行趋势相同，均显示北方LAC和南方HAC国家抗生素耐药性的差异。在少数情况下污水经处理后能降低除万古霉素ARG外所有检测的ARGs相对丰度，但处理后HAC的ARGs负担明显高于LAC国家。温度、抗生素的使用、UWTPs的规模大小和处理差异等是ARGs流行变化高度相关的因素。这些结果不仅加强了临床和环境AR之间的密切关系，也表明了在设计控制AR的策略时考虑社会和气候因素(如温度或降水)的重要性，以及在这项研究中监测对改善AR控制的重要性也很明显。使用传统粪便指标由于缺乏敏感性可能无法对污水AR状况进行可靠的比较。因此，需要设计简便、低成本、可利用高通量数据在全球范围内对污水中ARGs进行监测的方法。
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